May 29, 2024
ビーズ
Communications Biology volume 5、記事番号: 1206 (2022) この記事を引用 3909 アクセス 4 Altmetric メトリクスの詳細 G タンパク質共役受容体のアゴニスト駆動リン酸化の分析
Communications Biology volume 5、記事番号: 1206 (2022) この記事を引用
3909 アクセス
4 オルトメトリック
メトリクスの詳細
アゴニストによる G タンパク質共役受容体 (GPCR) のリン酸化の分析は、受容体の活性化状態とリガンドの薬理についての貴重な洞察を提供します。 しかし、これまでのところ、ハイスループットアプリケーションを使用した GPCR リン酸化の評価は困難でした。 我々は、マルチウェル細胞培養プレート内で完全に実行できる、アゴニスト誘発 GPCR リン酸化の定量的評価のためのビーズベースのイムノアッセイを開発し、検証しました。 このアッセイには、磁気ビーズを使用したアフィニティータグ付き受容体の免疫沈降と、それに続くリン酸化状態特異的およびリン酸化状態非依存性の抗 GPCR 抗体を使用したタンパク質の検出が含まれます。 概念の実証として、5 つの原型 GPCR (MOP、C5a1、D1、SST2、CB2) を異なるアゴニストとアンタゴニストで処理し、濃度反応曲線を作成しました。 次に、選択的細胞 GPCR キナーゼ (GRK) 阻害剤アッセイを確立するためにアプローチを拡張し、選択的 GRK5/6 阻害剤 (LDC8988) および非常に強力な汎 GRK 阻害剤 (LDC9728) を迅速に同定しました。 結論として、この汎用性の高い GPCR リン酸化アッセイは、リガンド プロファイリングや阻害剤スクリーニングに幅広く使用できます。
G タンパク質共役受容体 (GPCR) は、さまざまな化学的および物理的刺激の影響を媒介する重要なシグナル伝達物質であり、多くのヒト疾患の主要な薬物標的となります。 GPCR は 7 回膜貫通ドメインを持つ均一な構造を持っているため、7 回膜貫通受容体 (7TMR) とも呼ばれます。 内因性リガンドまたは外因性アゴニストによる活性化は、G タンパク質共役受容体キナーゼ (GRK) と呼ばれるキナーゼのファミリーによって認識される GPCR の構造変化を引き起こします1。 活性化受容体を認識する GRK の独特な能力により、細胞内のセリンおよびスレオニン残基でアゴニスト依存性のリン酸化が引き起こされます 2,3。 さらに、プロテインキナーゼ A および C、およびその他のセリン/スレオニン キナーゼなどのセカンド メッセンジャー制御キナーゼも GPCR リン酸化に関与する可能性があります 4、5、6。 GPCR のリン酸化は、主に受容体の脱感作と内部移行を開始する生物学的および薬理学的に重要なプロセスです 7,8。 リン酸化はまた、GPCR と β-アレスチンなどの細胞内アダプタータンパク質との相互作用を増加させ、シグナル伝達の第 2 波を引き起こす可能性があります 9、10、11、12。
初期の GPCR 研究は放射性全細胞リン酸化アッセイに基づいていましたが、これは高レベルの放射能を必要とし、個々のリン酸化セリンおよびスレオニン残基の同定には使用できません。 その後、研究はリンプロテオミクス解析に向けられましたが、それによって得られた定量的な情報は限られています 13。 現在、一般的なアプローチは、GPCR14、15、16、17、18 のリン酸化状態を特異的に認識する抗体に基づいています。 ホスホサイト特異的抗 GPCR 抗体が利用可能な場合、受容体リン酸化の時間的および空間的動態を解明し、関連するキナーゼとホスファターゼを同定し、受容体活性化を検出し、新しいリガンドの薬理学的特性をプロファイリングするための優れたツールとなります 19、20、21、22。 ただし、ホスホサイト特異的抗体は、技術的に困難で、サンプルサイズが小さく、定量化が困難なイムノブロッティングアプローチで主に使用されます。
製薬研究や学術研究では、大規模な化学ライブラリのスクリーニングを容易にするためにハイスループットアッセイが必要になることがよくあります。 受容体結合、G タンパク質シグナル伝達、およびアレスチン動員は利用可能な方法論で評価できますが、GPCR リン酸化を測定するための適切な技術は現在利用できません。 したがって、我々は、マルチウェル細胞培養プレートで完全に実行でき、中～高スループットのアプリケーションに役立つ定量的リン酸化イムノアッセイの開発において、リン酸化部位特異的抗 GPCR 抗体を活用することに動機付けられました (図 1)。 このアッセイは事実上すべての 7 回膜貫通受容体に適用できるため、「7TM リン酸化アッセイ」と呼ばれます。
95% confluency. The cells were cultured in the presence or absence of the agonist [D-Ala2,N-MePhe4,Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) and then lysed in detergent buffer containing protease and protein phosphatase (PPase) inhibitors. After plate centrifugation, lysates were transferred to U-bottom 96-well plates. MOPs were then immunoprecipitated using mouse anti-HA antibody-coated magnetic beads. After washing the beads under magnetic force, either phosphosite-specific rabbit antibodies that specifically recognized the S375-phosphorylated form of MOP (pS375-MOP) or antibodies that detected MOP in a phosphorylation-independent manner (np-MOP) were added to the cells (Fig. 2a). Primary antibody binding was then detected using commercially available enzyme-labeled secondary antibodies followed by addition of the respective enzyme substrate solution. The color reaction in DAMGO-treated wells was stopped when the optical density (OD) read at 405 nm reached 1.2, typically within 2 to 8 min. Under identical conditions, the OD of untreated wells was approximately 0.2, suggesting that DAMGO-induced S375 phosphorylation of MOP was specifically detected within the optimal dynamic range for 2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)-based enzyme immunoassay substrates (Fig. 2b). Omission of the magnetic beads or the primary or secondary antibodies or the use of untransfected cells resulted in OD readings of 0.2 or less. When DAMGO was added at different concentrations ranging from 10 nM to 10 µM in wells assayed using the anti-pS375-MOP antibody, we observed increasing OD readings with data points following the typical shape of a sigmoidal concentration–response curve (Fig. 2c). In contrast, all wells assayed using the anti-np-MOP antibody yielded an OD reading of ~0.8, independent of agonist exposure, indicating that all the MOPs had been identified (Fig. 2c). Next, we evaluated the effect of PPase inhibitors with both a pS375-MOP phosphorylation immunoassay and western blot assay with cells cultured in a multiwell plate. For the western blot analysis, cells were cultured and treated in 96-well plates as described and lysed in detergent buffer with or without PPase inhibitors. MOPs were immunoprecipitated with anti-HA magnetic beads. Immunoprecipitates were washed under magnetic force, and receptors were eluted from the beads into SDS-sample buffer by incubating the plates for 25 min at 43 °C. When these samples were immunoblotted with the anti-pS375-MOP antibody, a concentration-dependent increase in S375 phosphorylation was observed in samples cultured with PPase inhibitors but not in samples lysed without PPase inhibitors (Fig. 2d, top panel). When the blot was stripped and reprobed with the np-MOP antibody, similar levels of MOPs were detected in all the samples irrespective of the presence of PPase inhibitors or agonist exposure (Fig. 2d, bottom panel). For the in-well assay, cells were plated and grown, treated and lysed as in the western blot assay, except that the samples were directly immunoassayed in the plate. Similar to the results obtained by immunoblotting, the results of the assay performed with the anti-pS375-MOP antibody revealed a concentration-dependent increase in signal intensity only in the wells with PPase inhibitor-treated samples (Fig. 2e). In contrast, in wells assayed with the anti-np-MOP antibody, similar signals were observed independent of inhibitor or agonist treatment (Fig. 2f). Notably, a high degree of correlation between the concentration–response curves obtained through the immunoblot analysis and immunoassay was found (Supplementary Fig. 1). These results show that the addition of PPase inhibitors during cell lysis was an essential component of the assay. These results also show that anti-pS375-MOP antibody binding depended on agonist-induced receptor phosphorylation, which needed to be protected from PPase digestion during cell lysis. The anti-np-MOP antibody bound to receptors regardless of their phosphorylation status, and hence, using this antibody appeared to be a feasible means of controlling total receptor content./p>
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